Protein A 琼脂糖

Protein A 琼脂糖简介

蛋白A是从金黄*葡萄球菌中分离出的细菌细胞壁蛋白，主要通过Fc区域与大多数哺乳动物IgG结合。天然蛋白 A 包含 5 个 IgG 结合结构域和许多其他具有未知功能的结构域。后者已从重组蛋白A中消除，以减少非特异性结合。

蛋白 A 琼脂糖是一种 4% 高度交联的琼脂糖试剂，与重组蛋白 A 偶联，可有效纯化哺乳动物单克隆和多克隆抗体，如人 IgG、IgE、IgM。

Protein A 琼脂糖使用方法

1. Buffer 的准备：  

建议用高纯水配置 Buffer，且配置后通过 0.45 μm 滤膜过滤除菌。

2. 样品处理：

(1) 为了确保抗体样本能够高效结合在 Protein A Agarose 上，需要用平衡缓冲液稀释血清、腹水等，比例至少为 1:1；或者把样本放在平衡缓冲液中透析过夜。

(2) 样品在上样前离心或用 0.45 μm 滤膜过滤，可减少杂质、提高抗体纯化效率、防止堵塞柱子。

3. Protein A Agarose 的装填：

(1) 用去离子水冲洗柱底筛板，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出 1-2 cm 的去离子水。

(2) 将 Protein A Agarose 悬浮混匀，小心地将悬液连续倒入柱管中。借助玻璃棒沿着柱壁倒入悬液可减少气泡的产生。(3) 打开柱底部出口，最初让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速 1 mL/min，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以得到很好的装填效果。标记柱床高度。

4. 样品纯化：

(1) 平衡：使用至少 5 倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，让缓冲液缓慢流出，流速大约为 1 mL/min。

(2) 上样：利用泵或注射器上样。让样品缓慢流出，流速大约为 0.5-1 mL/min，收集流出液。如有必要，可以重复或循环上样以提高得率。

(3) 洗杂：用平衡缓冲液冲洗柱子，流速大约为 2 mL/min，直到 OD280 紫外吸收达到一个稳定的基线（一般 15-30 倍柱体积），收集流出液。

(4) 洗脱：洗杂完毕后，用 10-15 倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱子，流速大约为 1 mL/min，收集洗脱液，并立刻加入中和缓冲液（1/10 洗脱液体积）调节 pH 到 7.4。(3) SDS-PAGE 检测：将纯化得到的抗体样品（包括流出组分、洗杂部分和洗脱部分）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。

5. 填料再生：

使用 10 倍柱体积的盐酸胍溶液（6 M，pH 8.0）或洗脱缓冲液清洗，然后立即用 5 倍柱体积的平衡缓冲液清洗。Protein A Agarose 能够重复再生 10 次，而不会有明显的吸附量下降。

注意事项及储存

1.储存在 2°C-8°C，可稳定保存长达 2 年，Protein A Agarose 需保存在含有 20% 乙醇的平衡缓冲液中。

2.请勿离心、干燥或冷冻。